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WB實驗代測的優(yōu)勢及操作步驟

更新時間:2020-08-19      瀏覽次數(shù):1753
   一:WB實驗代測的優(yōu)勢:
  下面我們就做WB實驗代測的原理以及大致需要的操作做了一個匯總。
  1、western免疫印跡是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上,然后利用抗體進(jìn)行檢測。對已知表達(dá)蛋白,可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測,對新基因的表達(dá)產(chǎn)物,可通過融合部分的抗體檢測。
  2、與southern或northern雜交方法類似,但western免疫印跡采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳,被檢測物是蛋白質(zhì),“探針”是抗體,“顯色”用標(biāo)記的二抗。
  3、經(jīng)過page分離的蛋白質(zhì)樣品,轉(zhuǎn)移到固相載體上,固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì),且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。
  4、以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng),再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng),經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。
  二:WB實驗代測的操作步驟:
  1、蛋白質(zhì)樣品獲得:細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)后,可通過電泳上樣緩沖液直接裂解細(xì)胞,真核細(xì)胞加勻漿緩沖液,機械或超聲波室溫勻漿0.5-1min。然后4℃,13,000g離心15min。取上清液作為樣品。
  2、WesternBlot實驗電泳:制備電泳凝膠,進(jìn)行SDS-PAGE。
  3、WesternBlot實驗轉(zhuǎn)移:(半干式轉(zhuǎn)移)
  4、電泳結(jié)束后將膠條割至合適大小,用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡。
  5、膜處理:預(yù)先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜,浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中10min。
  6、轉(zhuǎn)膜:轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽極碳板、標(biāo)準(zhǔn)層濾紙、NC膜、凝膠、標(biāo)準(zhǔn)層濾紙、陰極碳板的順序放好,濾紙、凝膠、NC膜準(zhǔn)確對齊,每一步去除氣泡,上壓500g重物,將碳板上多余的液體吸干。
  7、接通電源,恒流1mA/cm2,轉(zhuǎn)移1.5hr。轉(zhuǎn)移結(jié)束后,斷開電源將膜取出,割取待測膜條做免疫印跡實驗。將有蛋白標(biāo)準(zhǔn)的條帶染色,放入膜染色液中50s后。
  8、在50%甲醇中多次脫色,至背景清晰,然后用雙蒸水洗,風(fēng)干夾于兩層濾紙中保存,留與顯色結(jié)果作對比。
  總結(jié):實驗代測中的優(yōu)勢及操作步驟,看完本文您就應(yīng)該有了基本的認(rèn)識和了解相信大家都明白了吧!總的來說,希望對大家有所幫助。
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